در کلیه تست های سنجش ایمنی اعم از رقابتی و غیر رقابتی، میزان ثابتی از مولکولهای نشاندار به همه چاهکها افزوده می شود.
لذا پس از انجام واکنش چنانچه اتصال آنتی ژن – آنتی بادی روی سیگنال ارسالی تاثیری نداشته باشد، کلیه لوله ها یا چاهکها داراری مولکولهای نشاندار یکسانی هستند و سیگنال همه آنها با هم برابر است یکسان بودن سیگنال مربوط به کلیه استاندارها ، کنترل ها و نمونه ها به معنای ناتوانی در سنجش و اندازه گیری است، به همین خاطر مرحله جداسازی مولکولهای نشاندار واکنش داده از مولکولهای نشاندار آزاد ، ضروری می باشد .
اینگونه سنجش ها که نیاز به جداسازی مولکولهای نشاندار در دو وضعیت دارند به سنجش غیریکنواخت یا Heterogenous معروف هستند.
به هر طریقی که بتوان مولکولهای نشاندار آزاد و متصل را جدا کرد رابطه ای میان غلظت و سیگنال ایجاد خواهد شد محققین از روشهای متعددی برای این امر استفاده نموده اند که در دو دسته کلی جای می گیرد:
- Liquid phase روش فاز مایع
- Solid phasa روش فاز جامد
در روش فاز مایع اجزای واکنش همگی در ابتدا محلول بوده و هیچکدام تثبیت نشده اند اما پس از واکنش میان آنتی ژن- آنتی بادی ، مولکولهای نشاندار واکنش داده را از مولکولهای آزاد مذکور جدا می کنند.
اگر یکی از اجزای واکنش را تثبیت کرده باشند روش را فاز جامد می گویند مثلا اگر آنتی ژن یا آنتی بادی بر روی سطحی مانند داخل چاهکها متصل شده باشد،این روش فاز جامد خوانده می شود. در روش فاز جامد ، ساده ترین راه برای جداسازی مولکولهای نشاندار واکنش داده از مولکولهای آزاد ،شستشوی ساده می باشد.
محلول های متعدد خاصی جهت شستشو مورد استفاده قرار می گیرند. در بین آنها محلولی که بیشترین کاربرد را دارد، فسفات بافری سالین یا PBS می باشد. در صورت نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد ، پایداری PBS برای مدت 2 ماه حفظ می شود. مخزن های محلول های شستشو دهنده 1 تا 3 لیتر گنجایش دارند.
همچنین به ازای هر چرخه در اکثر موارد 300 میکرولیتر محلول شستشو دهنده برای هر چاهک مصرف می شود.
عمل شستشو را به صورت دستی هم می توان انجام داد. در روش دستی پس از آماده سازی محلول شستشو از انواع سمپلرها و یا دیسپنسرهای دستی استفاده می گردد. معمولاً زمانی که تعداد آزمایشات محدود باشد، از روش دستی به خوبی می توان بهره گرفت. مثلاً به کمک یک سمپلر متغیر با حجم 300-230 لیتر، محلول شستشو را می توان از ظرفی مانند بشر به داخل چاهک ها منتقل نمود.
استفاده از سمپلرهای چند شاخه یا Multichannel موجب تسریع عمل شستشوی دستی خواهد شد. سمپلرهای مذکور که معمولاً 8 یا 12 شاخه هستند، محلول شستشو رابه طور همزمان به 8 یا 12 چاهک می افزایند.
در آزمایشگاه های بزرگ و یا مراکز تحقیقاتی خصوصاً در طرح های اپیدمیولوژیک که تعداد نمونه ها زیاد است، بهتر است از دستگاه میکروپلیت واشر استفاده گردد.
به چندین دلیل عمل شستشو توسط دستگاه الایزا واشر ارجح تر می باشد:
- شستشوی چاهک ها به طور هم زمان صورت می پذیرد
- احتمال آلوده شدن کاربر یا عوامل بیماری زای احتمالی موجود در نمونه کمتر بوده و به حداقل می رسد.
- احتمال آلودگی چاهک به چاهک در هنگام ریزش و مکش محلول شستشو به دلیل طراحی دو نیدل مجزا بسیار کمتر می شود
- بخاطر دقت در شستشو تعداد تکرار تست ها پایین آمده و همین موضوع باعث صرفه اقتصادی از لحاظ تامین کیت برای آزمایشگاه می شود.
- رعایت دقیق و صحیح soaktime در مقایسه با اپراتور
شستشو یکی از مراحل اساسی سنجشهای فاز جامد غیر یکنواخت است و به ان نیاز اساسی می باشد و برای خارج ساختن مولکولهای نشانداری که اتصال غیر ویژه دارند نیاز به شستشو داریم که این کار را با دستگاه الایزا واشر انجام می دهیم.
واشرهای میکروپلیت همچنین برای شستشوی کشت سلول ها ، آرایش ساختارهای پروتئینی ، وسترن بلات که در پروتکل های تخلیص سازی DNA استفاده می شوند کاربرد دارد.
قابلیت های واشرهای میکروپلیت توسط چندین پارامتر تعیین می شود:
- سازگاری قالب میکروپلیت (48 ، 96 یا 384 چاهک) ،
- تعداد کانال هد شستشو (6 ، 8 ، 16 ، 96 یا 384) ،
- تعداد مایعات توزیع شده (1 تا 5)
- و دامنه حجم های ریزش و مکش (10 میکرولیتر) تا (350 میکرو لیتر)
- که همه این پارامترها با توجه به مدل دستگاه و کاربرد آن در تستهای مختلف متفاوت است.
در دستگاه الایزا واشر
- تعداد چاهکها یا استریپ هایی که باید شستشو شود
- حجم محلول شستشو
- سرعت افزودن محلول شستشو
- تنظیم زمان soak time
- سرعت تخلیه محلول شستشو
- تعداد دفعات شستشو قابل تعیین و برنامه ریزی می باشد تنظیم پارامترهای فوق می تواند دقت و تکرار پذیری مرحله شستشو را تا حد قابل ملاحظه ای افزایش دهد.
از آنجایی که اغلب دستگاه های شستشوگر خودکار دارای حافظه می باشد میتوان برنامه شستشوی کیت های متفاوت را تعریف و در حافظه ثبت نمود تا در زمان استفاده از دستگاه با سرعت بیشتری مرحله شستشو را پشت سر گذاشت
همانطور که در اصول کلی مرحله شستشو اشاره شد خیساندن کوتاه مدت چاهک ها در محلول شستشو به جدا شدن اتصالات غیر اختصاصی کمک می کند این مرحله در دستگاههای خودکار تحت نام soak کردن مطرح میشود soak کردن یا خیساندن (در حدود ده ثانیه) به کیفیت مرحله شستشو کمک میکند سرعت افزودن محلول شستشو و یا سرعت تخلیه این محلول بر راندمان مرحله شستشو تاثیر می گذارد .اگر این سرعت بیش از حد زیاد باشد می تواند با استرس و تنش به آنتی بادی ها آسیب برساند و اگر حد بیش از حد کند باشد به هدف استفاده از دستگاه خودکار که همانا افزایش سرعت مرحله شستشو است لطمه وارد می کند ،لذا شدت این مراحل باید متناسب انتخاب شود.
بطور خلاصه باید گفت اغلب سنجش های ایمنی امروزه از نوع غیر یکنواخت می باشند. در این نوع سنجش ها مرحله شستشو نقش حیاتی دارد یعنی با حذف این مرحله اساسی سنجش زیر سوال رفته و اعتبار خود را از دست می دهد. کیفیت اجرای این مرحله نیز بر اعتبار نتایج تاثیر می گذارد.